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艱難梭菌(TCD-B)核酸檢測(cè)試劑盒(熒光PCR法)

更新日期: 2022-04-23
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                艱難梭菌(TCD-B)核酸檢測(cè)試劑盒(熒光PCR法)

【產(chǎn)品名稱(chēng)】

商品名稱(chēng):艱難梭菌(TCD-B)核酸檢測(cè)試劑盒(熒光 PCR 法)

Name :Diagnostic Kit for Clostridiumdifficile tcd-B gene (Real-Time PCR Method)

【包裝規(guī)格】50T/盒

【預(yù)期用途】

本試劑盒適用于檢測(cè)從水樣糞便等標(biāo)本中分離出的毒素 B 型艱難梭菌,用于艱難梭菌的輔助診斷,其檢測(cè)結(jié)果僅供臨床參考。

【檢驗(yàn)原理】

本試劑盒用一對(duì)艱難梭菌毒素 B 基因特異性引物,結(jié)合一條特異性熒光探針,用一步法熒光 RT-PCR 技術(shù)對(duì)艱難梭菌毒素 B 基因進(jìn)行體外擴(kuò)增檢測(cè),用于臨床上對(duì)可疑感染者的病原學(xué)診斷。

【試劑組成】

包裝規(guī)格

50T/盒

TCD-B 反應(yīng)液

500μL×2 管

酶液

50μL×1   管

TCD-B 陽(yáng)性質(zhì)控品

50μL ×1 管

陰性質(zhì)控品

250μL   ×1 管

說(shuō)明:不同批號(hào)的試劑盒組分不可交互使用。

【儲(chǔ)存條件及有效期】

-20℃±5℃,避光保存、運(yùn)輸、反復(fù)凍融次數(shù)不超過(guò) 5 次,有效期 12 個(gè)月。

【適用儀器】

ABI 、安捷倫 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列熒光定量 PCR 檢測(cè)儀。

【標(biāo)本采集】

取水樣便 0.5~1mL

【保存和運(yùn)輸】

上述標(biāo)本短期內(nèi)可保存于-20℃,長(zhǎng)期保存可置-70℃,但不能超過(guò) 6 個(gè)月,標(biāo)本運(yùn)送應(yīng)采用 2~8℃冰袋運(yùn)輸,嚴(yán)禁反復(fù)凍融。

【使用方法】

1.  樣品處理(樣本處理區(qū))

1.1     樣本前處理

13000rpm 離心 2min,去盡上清

1.2    核酸提取

推薦采用上海烜雅生物科技有限公司生產(chǎn)的核酸提取或純化試劑(磁珠法或離心柱法)進(jìn)行核酸提取,請(qǐng)    按照試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

2.  試劑配制(試劑準(zhǔn)備區(qū))

根據(jù)待檢測(cè)樣本總數(shù),設(shè)所需要的 PCR 反應(yīng)管管數(shù)為 N(N=樣本數(shù)+1 管陰性對(duì)照+1 管陽(yáng)性對(duì)照;反應(yīng)管數(shù)每滿(mǎn) 10 份,多配制 1 份),每測(cè)試反應(yīng)體系配制如下表:

試劑

TCD-B 反應(yīng)液

酶液

用量

20μL

1μL

將混合好的測(cè)試反應(yīng)液分裝到 PCR 反應(yīng)管中,21μL/管。

3.  加樣(樣本處理區(qū))

將步驟 1 提取的核酸、陽(yáng)性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取 4μL,分別加入相應(yīng)的反應(yīng)管中,蓋好管蓋,混勻, 短暫離心。

4.  PCR 擴(kuò)增(核酸擴(kuò)增區(qū))

4.1  將待檢測(cè)反應(yīng)管置于熒光定量 PCR 儀反應(yīng)槽內(nèi);

4.2  設(shè)置好通道、樣品信息,反應(yīng)體系設(shè)置為 25μL;

熒光通道選擇: 檢測(cè)通道(Reporter Dye)FAM, 淬滅通道(Quencher Dye)NONE,ABI 系列儀器請(qǐng)勿選擇 ROX 參比熒光,選擇 None 即可。

4.3  推薦循環(huán)參數(shù)設(shè)置:

步驟

循環(huán)數(shù)

溫度

時(shí)間

收集熒光信號(hào)


 

1

1 cycle

95℃

10min

2

40 cycles

94℃

15sec

55℃

30sec

5.  結(jié)果分析判定

5.1  結(jié)果分析條件設(shè)定

設(shè)置 Baseline 和 Threshold:一般直接按機(jī)器自動(dòng)分析的結(jié)果分析,當(dāng)曲線(xiàn)出現(xiàn)整體傾斜時(shí),根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié) Baseline 的 start 值(一般可在 3~15 范圍內(nèi)調(diào)節(jié))、stop 值(一般可在 5~20 范圍內(nèi)調(diào)節(jié)),以及

Threshold 的 Value 值(上下拖動(dòng)閾值線(xiàn)至高于陰性對(duì)照),重新分析結(jié)果。

5.2  結(jié)果判斷

陽(yáng)性:檢測(cè)通道 Ct 值≤35,且曲線(xiàn)有明顯的指數(shù)增長(zhǎng)曲線(xiàn);

可疑:檢測(cè)通道 35<Ct 值≤38,建議重復(fù)檢測(cè),如果檢測(cè)通道仍為 35<Ct 值≤38,且曲線(xiàn)有明顯的增長(zhǎng)曲線(xiàn), 判定為陽(yáng)性,否則為陰性;

陰性:樣本檢測(cè)結(jié)果 Ct 值>38 或無(wú) Ct 值。

6.  質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)

陰性質(zhì)控品:Ct>38 或無(wú) Ct 值顯示;

陽(yáng)性質(zhì)控品:擴(kuò)增曲線(xiàn)有明顯指數(shù)生長(zhǎng)期,且 Ct 值≤32; 以上條件應(yīng)同時(shí)滿(mǎn)足,否則實(shí)驗(yàn)視為無(wú)效。

1.  檢測(cè)方法的局限性

1. 樣本檢測(cè)結(jié)果與樣本收集、處理、運(yùn)送以及保存質(zhì)量有關(guān);

2. 樣本提取過(guò)程中沒(méi)有控制好交叉污染,會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果;

3. 陽(yáng)性對(duì)照、擴(kuò)增產(chǎn)物泄漏,會(huì)導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果;

4. 病原體在流行過(guò)程中基因突變、重組,會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果;

5. 不同的提取方法存在提取效率差異,會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果;

6. 試劑運(yùn)輸,保存不當(dāng)或試劑配制不準(zhǔn)確引起的試劑檢測(cè)效能下降,出現(xiàn)假陰性或定量檢測(cè)不準(zhǔn)確的結(jié)果;

7. 本檢測(cè)結(jié)果僅供參考,如須確診請(qǐng)結(jié)合臨床癥狀以及其他檢測(cè)手段。

【注意事項(xiàng)】

1. 所有操作嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行;

2. 試劑盒內(nèi)各種組分使用前應(yīng)自然融化,*混勻并短暫離心;

3. 反應(yīng)液應(yīng)避光保存;

4. 反應(yīng)中盡量避免氣泡存在,管蓋需蓋緊;

5. 使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)專(zhuān)用工作服;

6. 樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進(jìn)行,以免交叉污染;

7. 實(shí)驗(yàn)完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺(tái)和移液器;

8. 試劑盒里所有物品應(yīng)視為污染物對(duì)待,并按照《微生物生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室生物安全通則》進(jìn)行處理。

【生產(chǎn)企業(yè)】

企業(yè)名稱(chēng):上海晅科生物科技有限公司


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